Edición No. 16, Issue II, Enero 2020
1. INTRODUCCIÓN
La lignocelulosa es el principal y más abundante
componente de la biomasa renovable producida por la
fotosíntesis. Los tres principales componentes que la
constituyen son celulosa, hemicelulosa y lignina. Entre
ellas, las hemicelulosas están compuestas de complejas
mezclas de xilano, xiloglucano, glucomanano, arabino-
galactano y otros heteropolímeros [1], [2].
El xilano es el segundo polisacárido más abundante
en la naturaleza, representando aproximadamente un ter-
cio del carbono orgánico renovable de la Tierra. La hi-
drólisis de sus enlaces β-1,4, se lleva a cabo con la en-
zima xilanasa (endo-1,4- β -D-xilanohidrolasa; EC
3.2.1.8), conduciendo a productos tales como xilosa y
xilobiosa [3], [4].
En la actualidad el uso de las xilanasas a escala in-
dustrial tiene un campo muy amplio de aplicación. Entre
estos se encuentra el blanqueo de la pulpa en la industria
papelera, clarificación de jugos, bioconversión de resi-
duos lignocelulósicos y desechos agrícolas en productos
fermentables, mejoramiento de la consistencia de la cer-
veza y digestibilidad de alimentos balanceados [5].
Entre las aplicaciones citadas se destaca el uso de xi-
lanasas como sustituto de compuestos clorados para el
blanqueo de pulpa Kraft en la producción de papel, en
un proceso llamado biobleaching. El proceso tradicional
ha generado grandes cantidades de aguas residuales car-
gadas de compuestos organoclorados, de características
tóxicas, mutagénicas y resistentes a la biodegradación,
además de ser una de las mayores fuentes de contamina-
ción ambiental a nivel industrial [6].
Además, existen investigaciones enfocadas en la pro-
ducción de biocombustibles de segunda generación, los
cuales son los principales productos de la bioconversión
de materiales lignocelulósicos. Entre ellos “el etanol es
el combustible renovable más importante en términos de
volumen y valor de mercado” [7].
El uso de xilanasas en la producción de etanol de se-
gunda generación puede incrementar su efectividad, al
aprovechar la hemicelulosa, convirtiéndola en xilosa, la
cual es un azúcar fermentable. Además, la producción de
xilanasa con xilano purificado como sustrato no es via-
ble desde el punto de vista económico por su elevado
costo.
En este contexto el presente estudio se enfoca en la
optimización de la producción de xilanasa a partir de una
cepa bacteriana aislada por el personal del laboratorio
para enzimas, bioproductos y biorremediación de la uni-
versidad de Lakehead. Seguido de la evaluación de la
efectividad de diversos subproductos agroindustriales
lignocelulósicos de bajo costo ricos en hemicelulosa,
como sustratos para el cultivo de la cepa Bacillus sp. K1
y la consecuente producción de xilanasa bacteriana, ba-
sado en la tesis de grado [8].
2. METODOLOGIA
2.1. Cepa bacteriana y su activación
De acuerdo con Prasad & Qin [9] la bacteria Bacillus
sp. K1 fue aislada en las premisas de la Universidad de
Lakehead; a partir de una muestra de madera en estado
de putrefacción, se identificó como productora de celu-
lasa por Prasad & Qin y se preservó en refrigeración a -
83 °C. La cepa se encuentra registrada en el base de da-
tos del banco de genes NCBI (N° de acceso KP987117).
Una muestra de la cepa congelada fue cultivada en
una caja Petri con medio de cultivo Luria-Bertani y co-
locada en una incubadora a 37 ºC por 24 h. Para la acti-
vación de la bacteria a utilizarse en el estudio, se empleó
50 mL de medio de cultivo Luria-Bertani en un matraz,
para luego ser incubado por 15 h a 37 ºC y 200 rpm de
velocidad de agitación.
2.2. Cultivo de la cepa bacteriana
La bacteria activada se cultivó al 1% de inóculo en
20mL de medio MSM para verificar la producción de
xilanasa y crecimiento bacteriano en función del tiempo.
El medio utilizado consistió en: xilano purificado 1%,
nitrato de sodio 0,1 g, NaNO3 0,1%, K2HPO4 0,1%,
KCl 0,1%, MgSO4 0,05%, extracto de levadura 0,05%.
Las condiciones de fermentación fueron pH 7, 37 ºC y
200 rpm de agitación por 144 h. Las muestras fueron to-
madas cada 12 h y preservadas a -4°C.
2.3. Densidad óptica y medición de la actividad en-
zimática
2.3.1. Medición de la densidad óptica
El uso de la espectrofotometría para medir la densi-
dad óptica a 600 nm (OD600) de un cultivo bacteriano
con la finalidad monitorear el crecimiento ha sido una
técnica usual en microbiología [10]. Las muestras toma-
das cada 12 h se descongelaron lentamente en hielo y se
midió su densidad óptica en un espectrofotómetro La
densidad óptica de varias muestras se midió en un espec-
trofotómetro de microplacas Epoch™ fabricado por Bio-
Tek Instruments [11]. Con el uso del promedio de estas
mediciones se trazó la curva de crecimiento bacteriano.
2.3.2. Extracción de la enzima cruda
Las muestras se centrifugaron a 12000 rpm durante 3
min. El sobrenadante claro (extracto crudo) se utilizó
para el ensayo enzimático.
2.3.3. Ensayo de actividad enzimática para xilanasa
La producción de xilanasa se verificó con la medi-
ción de su actividad enzimática. Este método se funda-
menta en cuantificar la liberación de xilosa, con el uso
del reactivo, ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) [12]. El
reactivo usado es de marca Sigma Aldrich N° producto
D0550).