Artículo Congreso / Congress Paper
Recibido: 10-12-2019, Aprobado tras revisión: 20-01-2020
Forma sugerida de citación: Solis, T.; Calderón, C.; Liu, Y. (2020). “Optimización de la producción de xilanasa bacteriana a partir
de Bacillus sp. K1 con el uso de residuos lignocelulósicos”. Revista Técnica “energía”. No. 16, Issue II, Pp. 126-134
ISSN On-line: 2602-8492 - ISSN Impreso: 1390-5074
© 2020 Operador Nacional de Electricidad, CENACE
Optimization of Xylanase Production by Bacillus sp. K1 Using Lignocellulosic
Residues
Optimización de la Producción de Xilanasa Bacteriana a Partir de Bacillus sp.
K1 con el Uso de Residuos Lignocelulósicos
T. M. Solis
1
C. G. Calderón
1
Y. Liu
2
1
Escuela Superior Politécnica de Chimborazo, Riobamba, Ecuador
E-mail: terry.solis@espoch.edu.ec; cristinacalderont@espoch.edu.ec; liuyang@hutc.zj.cn
2
Escuela de Ciencias de la Vida, Huzhou University, Huzhou, China
E-mail: terry.solis@espoch.edu.ec; cristinacalderont@espoch.edu.ec; liuyang@hutc.zj.cn
Abstract
The xylanases are enzymes that hydrolyze xylan,
producing fermentable sugars such as xylose and
xylobiose. These enzymes have several industrial
applications, among which its use in biobleaching
and second-generation bioethanol stands out. The
main objective in the present study is the optimiza-
tion of the bacterial xylanase production by the
strain Bacillus sp. K1, which has been previously iso-
lated from rotting wood samples collected at Lake-
head University's premises for its Biology Depart-
ment. The variables investigated for optimization
were physical such as pH, temperature and inocu-
lum volume; and composition of the fermentation
medium such as carbon source, organic and inor-
ganic nitrogen source and percentage ratio between
these components. Additionally, the effect of metal
ions (sodium, potassium, magnesium, calcium, fer-
rous, nickelous, cupric, cobaltous and manganous)
and surfactants (Tween-20, dodecyl sodium sulfate
and Triton X-100) in the xylanase enzyme activity
was determined. The highest production of xylanase
was obtained after 36h fermentation and the opti-
mal physical conditions associated with the xylanase
production were pH 6, temperature 35 ºC and inoc-
ulum volume 1%. The optimum composition of the
fermentation medium consists of: wheat bran 4%,
glucose 0,5%, NH
4
NO
3
0,5%, K
2
HPO
4
0,1%, KCl
0,1%, MgSO
4
0,05%, peptone 0,5%, SDS 0,1%. The
enzyme activity generated is 264,96±7,89 IU/L, with
a 248,79% increase from the initial conditions. The
most important inhibitors were cupric and manga-
nous ions with 32,00% and 49,16% inhibition com-
pared to the control experiment.
Index terms

Submerged fermentation, Enzyme
production, Wheat bran, Second-generation bioeth-
anol.
Resumen
Las xilanasas son enzimas que hidrolizan el xilano,
produciendo azúcares fermentables tales como xi-
losa y xilobiosa con aplicaciones industriales muy
diversas entre las que destaca el biobleaching y la
producción de bioetanol de segunda generación. El
objetivo principal del presente estudio se enfoca en
la optimización de la producción de xilanasa bacte-
riana por parte de la bacteria Bacillus sp. K1. La
misma ha sido previamente aislada de muestras de
madera en putrefacción recolectadas en las premi-
sas de la Universidad de Lakehead para su Depar-
tamento de Biología. Las variables investigadas
para la optimización fueron físicas tales como pH,
temperatura y volumen de inóculo; y de composi-
ción del medio de fermentación tales como fuente de
carbono, fuente de nitrógeno orgánico e inorgánico
y relación porcentual entre dichos componentes.
Adicionalmente, se determinó el efecto de iones me-
tálicos (sodio, potasio, magnesio, calcio, ferroso, ni-
queloso, cúprico, cobaltoso y manganoso) y surfac-
tantes (Polisorbato-20, dodecil sulfato de sodio y
Triton X-100) en la actividad enzimática de la xila-
nasa producida. La mayor producción de xilanasa
fue tras 36h de fermentación y las condiciones físi-
cas óptimas asociadas a la producción de xilanasa
fueron pH 6, temperatura 35 ºC y volumen de
inóculo 1%. La composición óptima del medio de
fermentación determinada está constituida por:
Afrecho de trigo 4%, Glucosa 0,5%, NH
4
NO
3
0,5%,
K
2
HPO
4
0,1%, KCl 0,1%, MgSO
4
0,05%, peptona
0,5%, SDS 0,1%. La actividad enzimática generada
es de 264,96±7,89 IU/L, con un 248,79% de incre-
mento con respecto al inicial. Los inhibidores más
importantes fueron los iones cúprico y manganoso
con 32,00% y 49,16% de inhibición comparado con
el experimento de control.
Palabras claves

Fermentación sumergida, Pro-
ducción de enzimas, Afrecho de trigo, Bioetanol de
segunda generación.
126
Edición No. 16, Issue II, Enero 2020
1. INTRODUCCIÓN
La lignocelulosa es el principal y más abundante
componente de la biomasa renovable producida por la
fotosíntesis. Los tres principales componentes que la
constituyen son celulosa, hemicelulosa y lignina. Entre
ellas, las hemicelulosas están compuestas de complejas
mezclas de xilano, xiloglucano, glucomanano, arabino-
galactano y otros heteropolímeros [1], [2].
El xilano es el segundo polisacárido más abundante
en la naturaleza, representando aproximadamente un ter-
cio del carbono orgánico renovable de la Tierra. La hi-
drólisis de sus enlaces β-1,4, se lleva a cabo con la en-
zima xilanasa (endo-1,4- β -D-xilanohidrolasa; EC
3.2.1.8), conduciendo a productos tales como xilosa y
xilobiosa [3], [4].
En la actualidad el uso de las xilanasas a escala in-
dustrial tiene un campo muy amplio de aplicación. Entre
estos se encuentra el blanqueo de la pulpa en la industria
papelera, clarificación de jugos, bioconversión de resi-
duos lignocelulósicos y desechos agrícolas en productos
fermentables, mejoramiento de la consistencia de la cer-
veza y digestibilidad de alimentos balanceados [5].
Entre las aplicaciones citadas se destaca el uso de xi-
lanasas como sustituto de compuestos clorados para el
blanqueo de pulpa Kraft en la producción de papel, en
un proceso llamado biobleaching. El proceso tradicional
ha generado grandes cantidades de aguas residuales car-
gadas de compuestos organoclorados, de características
tóxicas, mutagénicas y resistentes a la biodegradación,
además de ser una de las mayores fuentes de contamina-
ción ambiental a nivel industrial [6].
Además, existen investigaciones enfocadas en la pro-
ducción de biocombustibles de segunda generación, los
cuales son los principales productos de la bioconversión
de materiales lignocelulósicos. Entre ellos “el etanol es
el combustible renovable más importante en términos de
volumen y valor de mercado” [7].
El uso de xilanasas en la producción de etanol de se-
gunda generación puede incrementar su efectividad, al
aprovechar la hemicelulosa, convirtiéndola en xilosa, la
cual es un azúcar fermentable. Además, la producción de
xilanasa con xilano purificado como sustrato no es via-
ble desde el punto de vista económico por su elevado
costo.
En este contexto el presente estudio se enfoca en la
optimización de la producción de xilanasa a partir de una
cepa bacteriana aislada por el personal del laboratorio
para enzimas, bioproductos y biorremediación de la uni-
versidad de Lakehead. Seguido de la evaluación de la
efectividad de diversos subproductos agroindustriales
lignocelulósicos de bajo costo ricos en hemicelulosa,
como sustratos para el cultivo de la cepa Bacillus sp. K1
y la consecuente producción de xilanasa bacteriana, ba-
sado en la tesis de grado [8].
2. METODOLOGIA
2.1. Cepa bacteriana y su activación
De acuerdo con Prasad & Qin [9] la bacteria Bacillus
sp. K1 fue aislada en las premisas de la Universidad de
Lakehead; a partir de una muestra de madera en estado
de putrefacción, se identificó como productora de celu-
lasa por Prasad & Qin y se preservó en refrigeración a -
83 °C. La cepa se encuentra registrada en el base de da-
tos del banco de genes NCBI (N° de acceso KP987117).
Una muestra de la cepa congelada fue cultivada en
una caja Petri con medio de cultivo Luria-Bertani y co-
locada en una incubadora a 37 ºC por 24 h. Para la acti-
vación de la bacteria a utilizarse en el estudio, se empleó
50 mL de medio de cultivo Luria-Bertani en un matraz,
para luego ser incubado por 15 h a 37 ºC y 200 rpm de
velocidad de agitación.
2.2. Cultivo de la cepa bacteriana
La bacteria activada se cultivó al 1% de inóculo en
20mL de medio MSM para verificar la producción de
xilanasa y crecimiento bacteriano en función del tiempo.
El medio utilizado consistió en: xilano purificado 1%,
nitrato de sodio 0,1 g, NaNO3 0,1%, K2HPO4 0,1%,
KCl 0,1%, MgSO4 0,05%, extracto de levadura 0,05%.
Las condiciones de fermentación fueron pH 7, 37 ºC y
200 rpm de agitación por 144 h. Las muestras fueron to-
madas cada 12 h y preservadas a -4°C.
2.3. Densidad óptica y medición de la actividad en-
zimática
2.3.1. Medición de la densidad óptica
El uso de la espectrofotometría para medir la densi-
dad óptica a 600 nm (OD600) de un cultivo bacteriano
con la finalidad monitorear el crecimiento ha sido una
técnica usual en microbiología [10]. Las muestras toma-
das cada 12 h se descongelaron lentamente en hielo y se
midió su densidad óptica en un espectrofotómetro La
densidad óptica de varias muestras se midió en un espec-
trofotómetro de microplacas Epoch™ fabricado por Bio-
Tek Instruments [11]. Con el uso del promedio de estas
mediciones se trazó la curva de crecimiento bacteriano.
2.3.2. Extracción de la enzima cruda
Las muestras se centrifugaron a 12000 rpm durante 3
min. El sobrenadante claro (extracto crudo) se utilizó
para el ensayo enzimático.
2.3.3. Ensayo de actividad enzimática para xilanasa
La producción de xilanasa se verificó con la medi-
ción de su actividad enzimática. Este método se funda-
menta en cuantificar la liberación de xilosa, con el uso
del reactivo, ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) [12]. El
reactivo usado es de marca Sigma Aldrich producto
D0550).
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Solis et al. / Optimización de la producción de xilanasa bacteriana con el uso de residuos lignocelulósicos
Este método requiere la construcción previa de una
curva de calibración con xilosa, reactivo de marca Sigma
Aldrich (N° producto X-0200000). La longitud de onda
utilizada fue de 540 nm. La curva de calibración se desa-
rrolló con diferentes soluciones de xilosa con una con-
centración en el rango de 0 a 800 μg/mL. Los experi-
mentos se realizaron por triplicado y la curva se cons-
truyó mediante la técnica de regresión lineal.
La mezcla de reacción contenía 20 μL de solución de
xilano purificado de espelta y avena, marca Sigma Al-
drich (N° producto X-0627) al 1% (preparada en tampón
citrato 0,05 M de pH 5,3) como sustrato, se incubaron 10
μL de extracto enzimático diluido y tampón citrato (0,05
M, pH 5,3) a 50 ºC durante 30 min y luego la reacción
se terminó mediante la adición de 60 μL de reactivo
DNS.
Se ejecutó un control simultáneo que contenía todos
los reactivos, y la reacción se terminó antes de la adición
del extracto de enzima. Las muestras se colocaron un
baño de agua hirviendo por 10 min, se enfriaron a tem-
peratura ambiente y se diluyeron a 300 μL con agua des-
tilada. La absorbancia de las muestras se determinó en
un espectrofotómetro a 540 nm [13].
La unidad de actividad de xilanasa se definió como
la cantidad de enzima que cataliza la liberación de 1
μmol de azúcar reductor equivalente a xilosa por litro
minuto en las condiciones de ensayo especificadas [12].
Los promedios de absorbancia obtenidos en cada en-
sayo fueron convertidos en concentración de xilosa
(µg/mL) con el uso de la curva de calibración previa-
mente realizada. La concentración de xilosa será trans-
formada en unidad de actividad enzimática mediante la
siguiente ecuación:





(1)
Donde
,
,

y M son constantes.
es el volu-
men total de reacción (0,03 mL),
es el volumen del
extracto enzimático (0,01 mL),

es el tiempo de incu-
bación (30 min) y es el peso molecular de xilosa (150
µg/ μmol). 
es la actividad de xilanasa (μmol xilosa/
Lmin) y es la Concentración de xilosa (µg/mL reac-
ción).
2.4. Optimización de las condiciones de fermenta-
ción
2.4.1. Optimización del pH
Se compararon diferentes pH en un rango de 3 a 9 en
las condiciones de cultivo en un matraz para verificar la
actividad enzimática óptima. Cada muestra se analizó a
las 36 h, cuando la actividad de xilanasa era más alta, en
base a los ensayos anteriores.
2.4.2. Optimización del volumen de inóculo
Se compararon diferentes volúmenes de inóculo de
0,5% a 10% en las condiciones de cultivo para verificar
la actividad óptima de la xilanasa. Cada muestra se ana-
lizó a las 36 h, cuando la actividad de xilanasa era más
alta, en base a los ensayos anteriores.
2.4.3. Optimización de la temperatura de fermenta-
ción
Se compararon diferentes temperaturas de 25 ºC a 45
ºC en las condiciones de cultivo para verificar la activi-
dad óptima de la xilanasa. Cada muestra se analizó a las
36 h, cuando la actividad de xilanasa era más alta, en
base a los ensayos anteriores.
2.5. Optimización del medio de fermentación
2.5.1. Optimización de la fuente de carbono
Se estudió el reemplazo del xilano purificado con di-
ferentes residuos: afrecho de trigo, paja de trigo, aserrín,
bagazo de maíz y hojas de olmo de roca (Ulmus thomasii
Sarg.) como fuente de carbono principal; y azúcares pu-
rificadas como: lactosa, sacarosa, D-sorbitol, D Fruc-
tosa, D- Glucosa como fuente suplementaria, en una
concentración de 1%. Finalmente, se probó con diferen-
tes concentraciones del residuo lignocelulósico optimi-
zado en un rango de 0,5% a 5%., suplementando el me-
dio de cultivo con 0,5% del azúcar purificado que de-
mostró incrementar la actividad enzimática en mayor
proporción.
2.5.2. Optimización de la fuente de nitrógeno
Las fuentes orgánicas de nitrógeno comparadas fue-
ron: extracto de levadura, peptona, úrea, extracto de
malta y triptona. A su vez las fuentes inorgánicas fueron:
sulfato de amonio, nitrato de potasio, cloruro de amonio,
nitrato de sodio y nitrato de amonio. Este experimento
mantuvo las condiciones de cultivo previamente optimi-
zadas con 1% de fuente de nitrógeno. Finalmente, se
probó con diferentes concentraciones de la fuente inor-
gánica de nitrógeno optimizada en un rango de 0,5% a
4%.
2.5.3. Relación entre la concentración fuente de ni-
trógeno/ carbono.
Se utilizó la relación ya optimizada entre la fuente de
carbono y nitrógeno inorgánica para ensayar diferentes
relaciones de concentración con la fuente orgánica de ni-
trógeno (8:1:1, 8:1:2, 8:1:4, 8:1:5, 8:1:6 y 8:1:8) en la
preparación del medio de cultivo para optimizar la acti-
vidad enzimática.
2.6. Efecto de iones metálicos y surfactantes
Se ensayaron diferentes iones metálicos (sodio, po-
tasio, magnesio, calcio, ferroso y niqueloso) con una
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